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Nachweis genomischer Imbalancen mittels DNA-Microarrays mit Ziel-Sequenzen unterschiedlicher Komplexitaet
Felix Kokocinski
  2000  
Die Analyse von Veränderungen der Kopienzahlen einzelner Bereiche des Genoms ist wichtig bei der Untersuchung von Krebserkrankungen, um einerseits molekulare Grundla-gen der Tumorgenese zu erforschen und andererseits eine präzisere Diagnose durchfüh-ren zu können. Hierbei hat die zytogenetische Methode der Vergleichenden Genomischen Hybridisierung (Comparative Genomic Hybridization, CGH) große Dienste geleistet. Um ein höheres Auflösungsvermögen bei der Detektion genomischer Imbalancen zu errei-chen, basiert die Matrix- oder Microarray-CGH (mCGH) als Weiterentwicklung der chro-mosomalen CGH auf Hybridisierungs-Reaktionen, die nicht auf vollständigen Chromoso-men, sondern auf einzelnen Fragmente definierter chromosomaler Loci stattfinden. Als Hybridisierungsziele der Fluoreszenz-markierten genomischen Proben wurden in bisheri-gen Protokollen der mCGH meist in PACs oder YACs klonierte Sequenzabschnitte ge-nutzt. Der Einsatz von Microarrays mit fixierten cDNA-Fragmenten würde einige Vorteile mit sich bringen. Zu nennen sind hier vor allem das weiter verbesserte Auflösungsvermö-gen und die Möglichkeit, in Parallel-Experimenten Studien zur Expression der betrachte-ten Loci durchführen zu können. In dieser Arbeit wurden Hybridisierungs-Experimente auf Microarrays durchgeführt, auf denen sowohl humane DNA-Sequenzen aus YAC- und PAC-Klonen, als auch cDNA-Fragmente als Zielstellen fixiert waren. Um den Einfluß der geringen Komplexität der cDNA-Moleküle auf die Hybridisierungs-Eigenschaften zu analysieren, wurden diese zu-sätzlich in unterschiedlichen Kombinationen eingesetzt. Exemplarisch wurde die chromosomale Region 13q14 untersucht, in der u.a. das Gen BCMS lokalisiert ist. Es handelt sich hierbei um ein mögliches Tumorsuppressor-Gen, das in dieser Arbeit mit seinen unterschiedlichen Spleiss-Varianten als cDNA-Hybridisierungsziele benutzt wurde. Um einen methodischen Vergleich zu ermöglichen, wurde mit Hilfe der chromosomalen CGH eine Charakterisierung der Kolonkarzinom-Zelllinie COLO-320 angefertigt. Mit der Matrix-CGH konnte eine Bestätigung von hiermit beschriebenen Imbalancen erreicht wer-den. Die Detektion des in der Zelllinie sehr stark überrepräsentierten c-MYC-Onkogens war sowohl mit PAC- als auch mit cDNA-Hybridisierungszielen leicht möglich, die weniger stark ausgeprägte Überrepräsentation des Bereiches 13q14 konnten mit einzelnen Vari-anten von Ziel-Molekülen und Kombinationen von cDNA-Sequenzen auf den Microarrays gezeigt werden. Eine Reihe experimenteller Parameter wurde im Detail untersucht. Für die verminderten Intensitäten der Fluoreszenzsignale der cDNA-Fragmente, konnte eine direkte Abhängig-keit der Signalstärke von der Komplexität der jeweiligen Ziel-Moleküle gezeigt werden. Um den Einfluß der unterschiedlichen Organisation von kodierenden Sequenzen bei ge-nomischer Proben-DNA (und den genomische Fragmente enthaltenden PACs und YACs) sowie der Intron-freien cDNA zu analysieren, wurde eine Expressions-Hybridisierung mit mRNA aus Pankreas- und Herzgewebe auf die gleiche Art von Microarrays durchgeführt. Die cDNA-Moleküle zeigten sich hier als weit besser geeignete Hybridisierungs-Ziele. Die Studie konnte zeigen, daß trotz verringerter Intensitätswerte eine Detektion von ge-nomischen Imbalancen mit cDNA-Microarrays möglich ist. Durch die Kombination einer großen Anzahl von Lokus-spezifischen cDNA-Molekülen (Erhöhung der Komplexität) und einer erhöhten Redundanz von Einzel-Hybridisierungszielen sollte die genomischen Ana-lyse auch von weniger stark amplifizierten Bereichen des Genoms möglich sein. Unter diesen Vorraussetzungen kann die cDNA-basierte mCGH als high-throughput-Methode mit hoher Auflösung in einer Vielzahl von Fragestellungen eingesetzt werden.
 

 
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